1482-ben a város ura, Lorenzo de Medici a két város közti béke megerősítésére Milánóba küldte a Mórnak is nevezett Lodovico Sforzához. Leonardo Milánóban festette a Sziklás Madonna című oltárképet és a Santa Maria delle Grazie kolostor refektóriumába Az utolsó vacsorát. A szekkó technikával készült falikép azt a drámai pillanatot örökíti meg, amikor Júdás árulására fény derül.
A milánói udvarban Leonardo elmélyült a katonai és műszaki tudományokban, az építészet, a folyadékok mechanikája, a ballisztika, az optika kérdéseit kutatta. Tizenhat évig dolgozott Francesco Sforza lovas szobrán, a tervek készítése közben született többek között híres ábrázolása az emberi test tökéletes arányairól, a körbe és négyzetbe írt emberről. A művész a munkát rá jellemző módon soha nem fejezte be, csak egy hét méter magas agyagmodellel készült el. A szoborra szánt bronzból a fejedelem végül ágyút öntetett, az agyagmodellt a Milánót elfoglaló XII. Lajos francia király íjászai céllövészetre használták, így megsemmisült.
Leonardo a következő időszakban megfordult Mantovában, Velencében, Firenzében, majd 1500-ban Cesare Borgia szolgálatába állt mint mérnök és katonai építész. Tökéletesítette a szárazföldi és hajókra szerelhető fegyvereket, megnövelte a mozsárágyúk tüzelőerejét, új csúcsíves lövedékeket, gránátokat, ágyúkat, kőhajítókat tervezett.
Mona Lisa
VIII. Károly francia király itáliai betörése után visszatért Firenzébe, ahol megkapta élete legnagyobb megbízatását: a Palazzo Vecchióban a firenzei győzelemmel végződött Anghiari csatát kellett megörökítenie a tanácsterem falán. A terem másik felén a Cascinai csata megfestésére Michelangelót kérték fel, de egyik zseni sem készült el a munkával. Leonardo ekkor festette leghíresebb képét, a világ egyik legismertebb remekművét, a Mona Lisát (La Gioconda), akinek talányos mosolyát évszázadok óta igyekeznek megfejteni. Az 1503-1505 körül festett kép Leonardo szinte egyetlen teljesen befejezett képe, amelyben összegezte mindazokat a festői eszközöket, amelyet az emberi arc, a fény és árnyék kezelése, valamint a táj ábrázolása terén megfigyelései során írásban és rajzban rögzített.